| dc.description.abstract | Norsk: Studie av det innate immunforsvaret hos meitemark kan brukes til å øke forståelsen av mekanismene som ligger til grunn for immunsystemet hos høyerestående dyr. I dette arbeidet har det blitt etablert og optimalisert metoder for ekstraksjon av immunceller, såkalt coelomocytter, fra meitemarken Dendrobaena veneta. Ulike ekstraksjonsbuffere har blitt testet og optimalisert med hensyn på størst celleutbytte og lavest mulig grad av celleaggregering. Resultatene viste at elektrostimulering var den mest effektive metoden og at LBSS buffer tilsatt EDTA og serum ga minst celleaggregeringer. Lite vet man om hva som styrer hvor bredspektret en immunrespons skal være. For å finne svaret på dette spørsmålet, vil det være naturlig å se på hvordan organismen responderer på ulike invaderende og ukjente stoffer eller organismer. Vi har arbeidet med å etablere og optimalisere metoder for studie av celleproliferasjon, som er en naturlig del av en immunrespons. Analyse av celleproliferasjon har blitt utført ved flowcytometri og fluorescensmikroskopi. Ulike DNA bindende fluorokromer har blitt testet for deteksjon av celleproliferasjon. For å trigge celleproliferasjon, ble mark elektrostimulert og tømt for coelomocytter gjentatte ganger. Meitemark har også blitt injisert med bakteriene Escherichia coli og Staphylococcus aureus og eventuell påfølgende respons i form av celleproliferasjon ble analysert ved flowcytometri og fluorescensmikroskopi. Av fluorokromene som ble testet, ga Hoechst 33258 (HOE) i kombinasjon med UV eksitasjon i flowcytometeret, de beste resultatene sett i forhold til et teoretisk riktig cellesyklus diagram. Det var allikevel ikke mulig å detektere celleproliferasjon av immunceller ved bruk av HOE, noe som kan skyldes et metodemessig problem. Utøvelse av antimikrobiell effekt er viktig for overlevelse hos alle organismer. Coelomvæske som ble ekstrahert fra Dendrobaena veneta ble testet for antimikrobiell effekt ved sonehemmingsforsøk, flowcytometri (med bruk av LIVE/DEAD® BacLight™ kit), PMA PCR metode og ved utplatningsforsøk. Etter sterilfiltrering og oppkonsentrering av cellefri coelomvæske ved hjelp av frysetørking, ble det detektert tydelig antimikrobiell effekt i den cellefrie løsningen mot bakteriene E. coli og S. aureus i utplatningsforsøk. Basert på resultatene om eksistens av antimikrobiell effekt, bør det gjøres videre studier for å kartlegge hvor bredspektret denne effekten er og for å kunne si noe om mekanismene som styrer dette.
English: The mechanisms underlying the immune system in higher organisms can be better understood by studying the innate immune system in earthworms. In this work we established and optimized methods for extraction of immune cells, called coelomocytes, from the worm Dendrobaena veneta. Different extraction solutions were tested and optimized with regard to the highest cell yield and the lowest possible degree of cell aggregation. The results showed that electrical stimulation was the most efficient method, and that the LBSS buffer containing added EDTA and serum gave the lowest degree of cell aggregation. Little is known about the mechanisms that determine how broad-spectred an immune response can or should be. To help answer to this question, it would be natural to look at how organisms respond to different invading organisms or unknown substances. Therefore, in this work, we attempted to establish and optimize methods for studying proliferation, which is a natural part of an immune response. Cell proliferation was analyzed by flow cytometry and fluorescence microscopy. Different fluorescent dyes were tested for detection of cell proliferation. To trigger cell proliferation, worms was electrostimulated repeatedly to drain them of coelomocytes. The cell proliferation response of earthworms injected with the bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus was analyzed by flow cytometry and in fluorescence microscope. The fluorescent dye Hoechst 33258 (HOE) used in combination with UV excitation, yielded results most consistent with the theoretic flow cytometric cell cycle diagram. However, we did not detect any cell proliferation of immune cells using HOE. Antimicrobial defence is important for the survival of all organisms. Coelomic fluid extracted from Dendrobaena veneta was tested for antimicrobial effects in zone inhibition experiments, flow cytometry (using the LIVE/DEAD® BacLight™ kit), by the PMA PCR and disk methods. Results from the disk method showed a clearly antimicrobial effect of the cell-free coelomic fluid, which had been sterile-filtered and concentrated by freeze-drying, against the bacteria E. coli and S. aureus. Based on these data, further studies should be performed to map out how broad-spectred this antimicrobial effect is and to understand more about the mechanisms controlling it. | en |
