Investigating the potential of Nanopore sequencing and Raman spectroscopy for rapid diagnosis of sepsis

Abstract

Bakterielle patogener kan forårsake livstruende infeksjoner, inkludert blodbaneinfeksjoner (BSI) og sepsis. Rask identifikasjon av patogenet og dets antibiotikaresistens eller følsomhet er avgjørende for effektiv behandling og for å redusere dødlighet. Tradisjonelle diagnostiske metoder er imidlertid tidkrevende, noe som gjør det utfordrende å foreskrive riktig antibiotika til riktig pasient til rett tid. Ved alvorlige infeksjoner er klinikere ofte tvunget til å foreskrive bredspektrede empiriske antibiotika, som kan være ineffektiv og bidra til det økende problemet med antimikrobiell resistens (AMR). Det er derfor et presserende behov for nye, raske diagnostiske metoder for å forbedre pasientutfallene og begrense spredningen av AMR. Denne avhandlingen fokuserte på å utvikle og evaluere innovative metoder for å forkorte tiden det tar å oppdage bakterielle patogener og deres AMR-gener ved BSI og sepsis, ved å benytte nye teknologier, inkludert metagenomisk neste generasjons sekvensering og Raman-spektroskopi. Nanopore-sekvenseringsbasert mNGS ble utført på blodprøver tilsatt kliniske bakterieisolater som er relevant for sepsis. Resultatene viste at nanopore-sekvensering kan identifisere patogener både i rene kulturer og blodprøver tilsatt sepsis-fremkallende bakterier. De kostnadseffektive Flongle-flowcellene identifiserte positivt bakterier og antibiotikaresistente genene i de første 1000 – 3000 lesingene som var tilgjengelige etter 10 minutter til 3 timer med sekvensering. Deretter undersøkte vi hvordan man kan redusere ventetiden for sepsisdiagnose ved kortere inkubasjon i tradisjonelle laboratorieinkubatorer, etterfulgt av nanopore-sekvensering. De testede patogenene ble vellykket identifisert ved en celletetthet på 102 – 104 kolonidannende enheter (CFU)/ml etter bare 2 timers inkubasjon og 40 minutter med sekvensering. Resistensgenene ble også identifisert ved 103 – 107 CFU/mL, etter 5 timers inkubasjon. Oppsummert kan inkubering av blodkulturer i standard laboratorieinkubatorer, etterfulgt av nanopore-sekvensering, muliggjøre en godt informert sepsisdiagnose innen 7 til 9 timer. De nyutviklede metodene for multi-eksitasjon Raman-spektroskopi (MX-RS) og multi-eksitasjon Surface Enhanced Raman-spektroskopi (MX-SERS) ble undersøkt for stammenivåklassifisering av bakterieisolater. MX-RS-modellen demonstrerte en makro-gjennomsnittsnøyaktighet på 67,4 % ved 532 nm eksitasjon og 75,3 % ved 785 nm eksitasjon, med makrogjennomsnittlige presisjonsverdier på henholdsvis 91 % og 96,7 %, basert på spektra iv innhentet ved hver bølgelengde. En tydelig forbedring ble imidelertid observert ved bruk av både 532 nm og 785 nm datasett som modellinput, og oppnådde makrogjennomsnittlig nøyaktighet og presisjon på henholdsvis 88% og 98%. MX-SERS identifiserte to testede bakterielle patogener med en nøyaktighet på > 99 % for det ene isolatet og 100 % for det andre. MX-SERS viste forbedret klassifiseringsnøyaktighet sammenlignet med SERS-spektre innhentet ved en enkelt bølgelengde. Disse resultatene samsvarte godt med helgenomsekvenseringsdata, som ble brukt som referanse. I tillegg undersøkte vi ulike vekstbetingelser for å redusere bakteriekulturtiden, og dermed redusere inkubasjons- og deteksjonstiden. Studien viste at en økning i inkubasjonstemperatur til 42°C og tilsetting av vitamin B12 til brain heart infusion-medium reduserte forsinkelsestiden for bakterievekst med 10 – 115 minutter. Denne reduksjonen i forsinkelsestiden er avgjørende da det gjør at bakteriene når den eksponentielle vekstfase raskere, noe som dermed redusere den totale deteksjonstiden. Konklusjonen med dette arbeidet er at med fortsatt forbedring og validering viser disse metodene, enten brukt individuelt eller i kombinasjon, betydelig potensiale for rask diagnostisering av bakterielle infeksjoner og AMR i kliniske miljøer. Denne utviklingen kan føre til redsert dødliget fra sepsis, mer fornuftig bruk av antibiotika og bidra til å redusere spredning av AMR.

Abstract: Bacterial pathogens can lead to life-threatening infections, such as bloodstream infections (BSIs) and sepsis. Rapid identification of the pathogen and its antibiotic susceptibility or resistance is essential for effective treatment and reducing mortality. However, traditional diagnostic methods are slow, making it difficult to provide the right antibiotic to the right patient promptly. In severe infections, clinicians are often compelled to prescribe broad-spectrum empirical antibiotics, which may be ineffective and contribute to the growing issue of antimicrobial resistance (AMR). Consequently, there is an urgent need for new rapid diagnostic methods to improve patient outcomes and curb the spread of AMR. This thesis focused on developing and evaluating innovative methods to shorten the time required to detect bacterial pathogens and their AMR genes in bloodstream infections (BSIs) and sepsis, utilizing emerging technologies such as metagenomic next-generation sequencing (mNGS) and Raman spectroscopy. Nanopore sequencing-based mNGS was conducted on blood samples spiked with clinical bacterial isolates relevant to sepsis. The findings demonstrated that nanopore sequencing can identify pathogens in both pure cultures and blood samples containing sepsis-causing bacteria. The cost-effective Flongle flow cells successfully identified bacteria and antibiotic-resistant genes in the first 1,000 – 3,000 reads available after 10 minutes to 3 hours of sequencing. Next, we investigated reducing the wait time for sepsis diagnosis using shorter incubation in traditional lab incubators followed by nanopore sequencing. The tested pathogens were successfully identified at 102 – 104 colony forming units per (CFU)/mL concentration after only 2 hours of incubation and 40 minutes of sequencing. Also, the resistance genes were identified at 103 – 107 CFU/mL achieved after 5 hours of incubation. In summary, incubating blood cultures in standard laboratory incubators, followed by nanopore sequencing, can enable a well-informed sepsis diagnosis within 7 to 9 hours. The newly developed multi-excitation Raman spectroscopy (MX-RS) and multi-excitation Surface-enhanced Raman spectroscopy (MX-SERS) methods were investigated for the strain-level classification of bacterial isolates. The MX-RS model demonstrated a macro-average accuracy of 67.4% at 532 nm excitation and 75.3% at 785 nm excitation, with macro-average precision values of 91% and 96.7%, respectively, using spectra acquired at each wavelength. However, a clear improvement was observed using both 532 nm and 785 nm ii datasets as model inputs, achieving macro-average accuracy and precision of 88% and 98%, respectively. MX-SERS identified two tested bacterial pathogens with an accuracy of > 99% for one isolate and 100% for the other. MX-SERS showed improved classification accuracy compared to SERS spectra acquired with a single wavelength. These results aligned well with whole genome sequencing data, which served as the reference. Additionally, we explored various growth conditions to shorten bacterial culture time, thereby minimizing incubation and detection time. The study revealed that increasing the incubation temperature to 42°C and supplementing the brain heart infusion medium with vitamin B12 reduced the bacterial growth lag time by 10 to 115 minutes. This reduction in lag time is critical, as it allows bacteria to reach the exponential growth phase sooner, thus shortening the overall detection time. In conclusion, with continued improvements and validation, these methods, whether used individually or in combination, show significant potential for rapidly diagnosing bacterial infections and AMR in clinical settings. This advancement could lead to reduced mortality rates, more judicious use of antibiotics, and help prevent the spread of AMR.