Porcine oocyte quality, in vitro embryo production and storage

Abstract

I svineavlsindustrien er embryo-overføring en teknikk som forventes å endre eksport og import av genetikk betydelig i fremtiden. Foruten genetisk framgang, bidrar embryooverføring til økt biosikkerhet. Begrensende faktorer for bruk av embryooverføring er imidlertid produksjonen og lagring av embryo, siden suboptimale in vitro vekstforhold påvirker embryoutvikling og kvalitet, og svineembryo er svært sensitive for frysing. Økt kunnskap om hva som differensierer eggceller av lav eller høy kvalitet er av vesentlig verdi for å forstå og forbedre in vitro embryoproduksjon. Målet for denne avhandlingen var å studere lagring av in vitro produserte svineembryo og identifisere nye kvalitetsmarkører for eggceller. I artikkel 1 ble kvalitet til in vitro produserte svineblastocyster undersøkt etter 3 timer lagring i CO2-fritt medium ved 37 °C, ved å evaluere morfologi, evne til å utvikle seg videre in vitro og apoptose. Studiet viste at 3 timer lagring ikke påvirket embryokvaliteten da det ikke var noen signifikante forskjeller mellom lagrings- og kontrollgruppen etter 3 timer lagring og ytterligere 24 timer konvensjonell inkubering. Målet til artikkel 2 var å identifisere nye markører for kvalitet av eggceller fra svin ved å undersøke uttrykk av utvalgte gener i kumulusceller og eggceller, ved å bruke en modell der eggceller fra voksne dyr antas å være av høyere kvalitet enn fra yngre, prepubertale dyr. Dette studiet identifiserte redusert uttrykk av BBOX1 og høyere uttrykk av CPT2 i kumulusceller før modning, og høyere uttrykk av G6PD og ALDOA etter modning som potensielle nye markører for eggcellekvalitet. Målet med artikkel 3 var å studere mengden av utvalgte epigenetikk-relaterte transkripter i eggceller av ulik kvalitet. Dette studiet krevde validering av referansegenene og identifiserte kombinasjonen av ACTB og PFKP som den optimale normaliseringen for RT-qPCR data fra eggcellene. Transkripsjon så ikke ut til å være stanset på aspirasjonstidspunktet i eggceller samlet fra prepubertale hunngris, og muligens ikke innen gjenopptak av meiose. Resultatene indikerte forsinket akkumulering av transkripter som støtter histonmodifikasjoner tilknyttet maternell imprinting, fortsettelse av meiose og embryonal genomaktivering i eggceller fra prepubertale gris sammenlignet med purker. Resultatene antyder at de undersøkte transkriptene kan ha potensiale som markører for eggcellekvalitet.

Abstract: In the pig breeding industry, embryo transfer is a technique expected to significantly change export and import of genetics in the future. Besides genetic gain, an advantage of embryo transfer is increased biosecurity. However, limiting factors for embryo transfer are embryo production and storage, since non-optimal in vitro culture conditions are affecting embryo development and quality, and porcine embryos are highly sensitive to freezing. Gaining knowledge on what differentiates low- or high-quality oocytes is of significant value to understand and improve in vitro embryo production. The focus of this thesis was storage of porcine in vitro produced embryos and the identification of novel oocyte quality parameters. The aim of paper 1 was to assess embryo quality of in vitro produced porcine blastocysts after 3 h liquid storage at 37 °C in CO2-free medium by evaluating morphology, in vitro developmental capacity and apoptosis. The study demonstrated that 3 h storage did not affect embryo quality as there was no significant difference between the storage and control group after 3 h storage and the further 24 h conventional incubation. Paper 2 aimed to identify novel parameters for porcine oocyte quality by examining expression of selected genes in cumulus cells (CCs) and oocytes, by employing the model assuming oocytes from adult, cycling animals being of higher quality compared to those from prepubertal animals. The study identified reduced expression of BBOX1 and higher expression of CPT2 in CCs before maturation and higher expression of G6PD and ALDOA after maturation as potential novel markers of oocyte quality. Paper 3 examined the abundance of transcripts supporting histone modifications during oocyte and early embryo development in oocytes of contrasting quality. This latter study required validation of the reference genes and identified the combined use of ACTB and PFKP as the most optimal normalisation for the porcine oocyte RT-qPCR data. Transcription did not appear to be silenced at the time of aspiration in oocytes collected from prepubertal gilts, and possibly not prior to resumption of meiosis. The results indicated delayed accumulation of transcripts supporting histone modifications associated with maternal imprinting, meiotic resumption, and embryonic genome activation in prepubertal gilt oocytes compared to sows. The results imply the investigated transcripts may have potential as markers of oocyte quality.