The effect of the viral suppressor protein p38 on anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis thaliana

Abstract

English: In this project, the effect of expressing p38, a viral suppressor of RNA silencing encoded by Turnip Crinckle Virus (TCV), in Arabidopsis and Chlamydomonas was investigated. Transgenic Arabidopsis At RCHSp38 plants, which co-express an IR-transgene designed to induce RNA silencing of the endogenous chalcone synthase (CHS) gene and the RNA silencing suppressor protein p38, are known to accumulate high levels of anthocyanins. Our hypothesis was that the increased levels of anthocyanin in At RCHSp38 plants was a consequence of p38 expression leading to increased levels of the transcription factor MYB75/PAP1, as a result of p38-induced impaired RNA silencing control of MYB75/PAP1. To investigate our hypothesis, transcript levels of the flavonoid biosynthesis genes phenylalanine ammonia lyase (PAL1), CHS, dihydroflavonolreductase (DFR), glutathione S-transferase (GST), and MYB75/PAP1, were determined using quantitative real-time PCR in selected At RCHSp38 lines and compared to the same transcript levels in wild-type and At PAP1 plants, which over-expresses MYB75/PAP1. The effect of stress exposure with high sucrose concentration and high intensity light treatment on At RCHSp38 plants compared to wild-type and At PAP1 plants was also studied, to investigate if stress could elucidate differences in the transcript levels of the investigated genes among the different plant lines. Finally, phenotypic investigations of leaves and flowers in At RCHSp38 plants were undertaken. The results show that the transcript levels of MYB75/PAP1, PAL1, CHS, DFR, and GST are up-regulated both in transgenic At RCHSp38 seedlings and adult plants compared to wild-type plants grown under the same experimental conditions, and in At RCHSp38 seedlings and plants exposed to stress. At RCHSp38 seedlings and adult plants also showed an altered phenotype with a more intense purple colouration compared to wild-type plants. The elevated level of MYB75/PAP1 in At RCHSp38 plants indicate that this transcription factor is under RNA silencing control, which becomes impaired under p38-expression. A tasiRNA targeting MYB75/PAP1 has been identified in previous studies and further analyses to confirm tasiRNA regulation of MYB75/PAP1 and whether p38-expression interferes with tasiRNA biogenesis should be performed. Low level of transgene expression is a problem in Chlamydomonas. If low transgene expression is the result of transgene silencing, a possible solution is to use suppressors of RNA silencing in vector constructs to insulate your favourite transgene from silencing. We wanted to investigate if expression of the p38 protein in Chlamydomonas could suppress RNA silencing, more specifically if p38 could suppress RNA silencing of the endogenous phytoene synthase (PSY) gene induced by artificial microRNAs (amiRNAs). After successful induction of RNA silencing in transformed cells, we wanted to introduce p38 to investigate if the effect of RNA silencing of PSY was reduced or abolished. However, we were not able to successfully transform Chlamydomonas cells with the amiRNAs designed to silence PSY. Further studies to successfully transform Chlamydomonas cells, both with amiRNAs designed to silence PSY and with the p38-expression construct, are needed to answer the question whether p38 expression is able to reduce or abolish RNA silencing induced by amiRNAs.

Norsk: I dette prosjektet har effekten av å uttrykke p38, et ‟RNA silencing‟ suppressor protein fra Turnip Crinckle Virus (TCV), i Arabidopsis og Chlamydomonas blitt undersøkt. Tidligere studier har vist at transgene Arabidopsis At RCHSp38 planter som uttrykker både et IR-transgen konstruert for å indusere „RNA silencing‟ av det endogene chalcone synthase (CHS) genet, og det virale suppressor proteinet p38, akkumulerer høye nivåer av antocyaniner. Vår hypotese var at det høye nivået av antocyaniner i At RCHSp38 planter skyltes uttrykk av p38 som igjen fører til induksjon av transkripsjonsfaktoren MYB75/PAP1, et resultat av at p38 reduserer „RNA silencing‟ kontroll av MYB75/PAP1. For å undersøke vår hypotese ble transkripsjonsnivå av følgende flavonoid biosyntese gener analysert ved bruk av kvantitativ real-time PCR i utvalgte At RCHSp38 plantelinjer, og sammenlignet med de samme transkripsjonsnivå i villtype og At PAP1 planter, som overuttrykker MYB75/PAP1: phenylalanine ammonia lyase (PAL1), CHS, dihydroflavonolreductase (DFR), glutathione S-transferase (GST) og MYB75/PAP1. Effekten av å utsette At RCHSp38 plantene for stress ved å dyrke plantene på agar medium med høy sukrose konsentrasjon og ved å inkubere plantene med høy lys intensitet, ble studert for å undersøke om stress kunne tydeliggjøre forskjeller i transkripsjonsnivå hos de undersøkte genene blant de forskjellige plantelinjene. Det ble også utført fenotypiske analyser av At RCHSp38 plantenes blad og blomster. Resultatene viser at transkripsjonsnivå av MYB75/PAP1, PAL1, CHS, DFR, og GST er oppregulert i både transgene At RCHSp38 kimplanter og voksne planter sammenlignet med villtype planter dyrket under de samme forsøksbetingelsene og i At RCHSp38 planter utsatt for stress. At RCHSp38 kimplanter og voksne planter viser en forandret fenotype med en mer intens lilla farge i forhold til villtype planter. Det økte nivået av MYB75/PAP1 i At RCHSp38 planter er en indikasjon på at denne transkripsjonsfaktoren er under „RNA silencing‟ kontroll, hvorpå denne mekanismen forstyrres som følge av p38 uttrykk. I tidligere studier har et tasiRNA med MYB75/PAP1 som mål blitt identifisert, og videre undersøkelser for å bekrefte tasiRNA regulering av MYB75/PAP1 og hvorvidt p38 uttrykk forstyrrer tasiRNA biogenese bør utføres. Lavt nivå av transgent uttrykk er et problem i Chlamydomonas. Hvis det lave transgene uttrykket kommer av transgen inaktivering er en mulig løsning å bruke „RNA silencing‟ suppressor proteiner i vektorkonstrukter for å isolere transgenet fra inaktivering. Vi ville undersøke om uttrykk av p38 proteinet i Chlamydomonas kunne undertrykke „RNA silencing‟, mer spesifikt om p38 kunne undertrykke „RNA silencing‟ av det endogene phytoene synthase (PSY) genet indusert ved bruk av kunstige microRNAer (amiRNAer). Etter å ha indusert „RNA silencing‟ i transformerte celler, ville vi introdusere p38 for å undersøke om effekten av „RNA silencing‟ av PSY ble redusert eller opphevet. Våre forsøk på å transformere Chlamydomonas celler med amiRNAer var ikke vellykkede. For å svare på spørsmålet om hvorvidt utrykk av p38 kan undertrykke eller oppheve ‟RNA silencing‟ indusert av amiRNAer, må videre studier utføres for å lykkes med å transformere Chlamydomonas celler, både med amiRNAer laget for å undertrykke PSY og med p38 uttrykkskonstruktet.