Utvikling av mikrosatellitt multipleks PCR for genetiske studier av Margaritifera margaritifera

Abstract

Norsk: Den utrydningstruede elvemuslingen (Margaritifera margaritifera) er en viktig nøkkeart i økosystemet den lever i. De siste hundre årene har det imidlertid vært en sterk nedgang i antall individer og populasjoner av elvemusling over hele Europa. Utvikling av polymorfe mikrosatellittmarkører vil kunne benyttes til kartlegging av genetisk variasjon for norske elvemusling populasjoner, og være et viktig verktøy til utarbeidelse av bevaringsbiologiske tiltak for elvemusling i Norge. Ved bruk av 454-sekvenseringsteknikk fikk vi identifisert 201 mikrosatellittloci, hvor 17 ble evaluert for inkludering i et multipleks PCR-oppsett. Kostnader ved genotyping er betydelige, derfor utviklet og optimaliserte vi to multipleks PCR-reaksjoner med henholdsvis 6 nyutviklede og 5 etablerte markører i PCR-reaksjonene. Et begrenset populasjonsstudie på 132 individer fra 5 populasjoner ble utført. Resultater viser at alle markørene er polymorfe, med gjennomsnittlig allelantall på 4,5 allel per loci. 4 av populasjonene viste svært liten genetisk variasjon og hadde flere monomorfe loci (gjennomsnittlig He: 0,02 – 0,15), mens den siste populasjonen viste god genetisk variasjon (gjennomsnittlig He: 0,53). Tester og analyser viste at markørene ga reproduserbare resultater med lav feilrate, utenom for to av markørene (Mm2235 og MarMa5167), som bør evalueres mer nøye. Dette studiet viser at det å utvikle multipleks PCR-oppsett for genotyping av elvemusling er oppnåelig.

English: The threatened freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera) plays an important role in the freshwater ecosystem. During the last century there has been a dramatically decline in freshwater pearl mussel populations all over Europe. Development of polymorphic microsatellite markers has the potential to estimate genetic variations in Norwegian pearl mussel populations, and be an important tool in developing conservation plans for the species. By using a 454-sequencing technique we were able to identify 201 microsatellite loci, where 17 of these were evaluated for use in a multiplex PCR system. The costs of genotyping are substantial, due to this reason we developed and optimized 2 multiplex PCR reactions with 6 new markers and 5 established markers. A limited population study was performed with results showing that all the markers are polymorphic, with average allel numbers of 4,5 alleles per loci. 4 of the population showed low genetic variation and had several monomorphic loci (average He: 0,02 – 0,15), while the last population had good genetic variation (average He: 0,53). Test and analysis showed that the markers gave reproducible results with a low margin of errors. This was not the case for 2 of the markers (Mm2235 and MarMa5167), which should be more thoroughly evaluated. This study shows that development of multiple PCR system for genotyping of fresh water pearl mussel is achievable.